CRISPR/Cas9 系統是快速生成敲除細胞系的強大工具。很多敲除細胞系已經在最近的許多科研工作中被證明是有用的，允許科研人員確定未表征基因的功能，分析等基因背景中的敲除，并驗證小分子抑制劑和 RNAi 構建體的活性。盡管如此，在大多數實驗環境中生成和建立敲除細胞系時，我們需要考慮幾個重要的因素。

首先，重要的是要考慮單細胞分離前細胞群中可能存在的遺傳、表觀遺傳和表型異質性。從單個細胞重新獲得細胞系是一個重要的遺傳瓶頸，如果單細胞衍生的克隆僅捕獲起始細胞群中存在的多樣性的一個子集，則實驗可能會混淆。事實上，眾所周知，一些已建立的細胞系表現出顯著的克隆間異質性; 例如，來自廣泛使用的 MDA-MB-231 乳腺癌細胞系的克隆之間的增殖能力存在相當大的差異。由于親本異質性的可能性，分析多個獨立的敲除細胞系以確保任何意外結果不是克隆偽影，這一點絕對至關重要。

其次，挑戰單個細胞增殖以形成數百萬個細胞的克隆群體代表了顯著的選擇壓力?？梢韵胂?，這種壓力可能會豐富不斷增長的克隆中促進增殖的某些遺傳和表觀遺傳改變。為了解釋這種選擇力，重要的是將實驗敲除與在類似條件下獲得的克隆“對照”細胞系進行比較。這些對照細胞還應攜帶靶向已建立的非必需位點的 Cas9 和/或 gRNA，以解釋對 CRISPR 誘導的 DNA 損傷的任何非特異性反應。根據經驗所知，與基因組中沒有任何靶位點的指南相比，靶向已確認的非必要位點的指南具有輕微但顯著的影響。

作為最小化細胞克隆影響或驗證意外結果的替代方法，可以考慮在生成克隆敲除細胞系的同時進行批量 CRISPR 測定。在批量測定中，gRNA 可以通過轉染或轉導引入受體細胞系。如果有足夠的細胞表達感興趣的引導 RNA，則可以直接對該群體進行測定。

Aimsmass 可提供敲除細胞系的建立服務，借助高通量我司所采取的高通量敲除手段，快速建立單克隆敲除細胞株。我們采取的是直接將 Cas9 蛋白與所需 gRNA 結合的核糖核蛋白（RNP）復合物導入細胞。RNP 的直接遞送一方面加速了基因編輯動力學，另一方面減輕了由于 Cas9 快速降解而導致的脫靶效應。此外，由于 RNP 方法的無 DNA 性質，避免了潛在的轉基因插入。