大多數細胞生物學實驗使用短暫轉染方案，在轉染后的24-96小時內達到基因表達的峰值。然而，如果需要長時間持續的基因表達，構建穩定的細胞系是一個可行的選擇。此外，通過限制稀釋選擇的穩定細胞系提供了遺傳同質和克隆的細胞群體。
穩定細胞系的構建可以通過使用陽性選擇標記物（如 hygromycin、G418/Geneticin、zeocin 和 blasticidin 抗生素耐藥性）來實現。選擇標記物可以通過與目標基因在同一質粒上（cis 方式）或與含有目標基因的質粒共轉染（trans 方式）來傳遞。cis 方法通常較為簡單，并且更有可能產生抗藥性穩定轉染體，表達目標基因。當目標構建在質粒骨架中不含抗生素耐藥基因時，trans 共轉染方法是一個很好的選擇。在這種情況下，可以將含有5至10份基因表達質粒和1份抗生素選擇標記質粒的質?；旌衔镆爰毎?。這種質粒比例有助于確保所選細胞同時表達目標基因和選擇標記物。
1. sgRNA 驗證：在實驗開始前，可以通過 sgRNA 在線驗證，篩選高效率的 sgRNA 用于敲除細胞系的構建。
2. 基因拷貝數：建議在開始實驗之前確定目標基因的拷貝數。
3. 質粒質量：使用高質量無內毒素的質粒 DNA。
4. 細胞條件：使用維護良好并經過常規認證的高質量細胞，包括檢測細菌，真菌或支原體污染。如果細胞來自新復蘇的細胞，則在使用前至少完成2次傳代。
5. 設計和合成 sgRNA 和基因型引物。
6. 用 Cas9 和 sgRNA 轉染細胞。
7. 使用適當的選擇標記篩選敲除細胞。
8. 單細胞克隆分離。
9. 使用 PCR 和測序篩選克隆以確認敲除。
10. 擴增陽性克隆。
11. 通過 Western 印跡或其他方法驗證敲除。
12. 檢測支原體污染并凍存穩定敲除細胞。
實驗流程 |
 |
服務流程 |
|
