敲除細胞池是使用 CRISPR-Cas9 技術生成的異質細胞群體，其中特定基因被靶向敲除。該過程涉及設計和合成靶向感興趣基因的導向 RNA（gRNA），將 CRISPR-Cas9 試劑轉染到細胞中，并允許細胞增殖。由于轉染效率和 CRISPR-Cas9 活性不會達到100％，敲除細胞池將是具有不同基因型的細胞混合物。
1.設計和構建 CRISPR-Cas9 試劑：包括設計和合成靶向感興趣基因的導向 RNA（gRNA）。
2.細胞轉染：將 CRISPR-Cas9 試劑與 gRNA 一起轉染到目標細胞中，使用電穿孔或脂質介導轉染等方法。
3.轉染細胞的篩選：轉染后，通常使用適當的標記物（如抗生素抗性或熒光蛋白）對細胞進行篩選，以富集攝取 CRISPR-Cas9 試劑的細胞。
4.轉染細胞的擴增：選擇的細胞在培養中被允許增殖和擴展，以生成敲除細胞池。
5.敲除效率分析：可以使用 PCR、Western blotting 或測序等各種方法評估敲除池的敲除效率，以確認目標基因的破壞。
6.敲除池的表征：通過分析細胞的異質性并評估基因敲除的功能后果來表征敲除池。
需要注意的是，敲除細胞池是一種由具有不同基因型的細胞組成的異質混合物，因為轉染效率和 CRISPR-Cas9 活性并不是100％高效的。這與克隆敲除細胞系形成對比，后者涉及隔離和擴增具有特定敲除基因型的單個細胞。
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