CRISPR-Cas9 系統利用短的合成引導 RNA 來指導 Cas9 酶在基因組中切割目標位置。通過 CRISPR-Cas9 敲除基因通常發生插入/缺失突變，其中單個引導 RNA（sgRNA）將 Cas9 引導到宿主基因組中的精確位置，Cas9 在基因組 DNA 中創建雙鏈斷裂（DSB）[1]。通過單個引導RNA（gRNA）引起的插入或缺失常用于產生敲除細胞，但是一些細胞通過跳過受擾亂的外顯子或使用剪接變異體來表達目標基因，從而失去目標外顯子[3]。為了克服目標基因的意外表達，幾乎可以將整個基因與選擇標記交換[2]。然而，創建一個包含 5'和 3'同源臂以及選擇標記的靶向載體是耗時的。一種簡單易行的方法稱為 SUCCESS（Single-strand oligodeoxynucleotides, Universal Cassette, and CRISPR/Cas9 produce Easy Simple knock-out System）可用于在不構建靶向載體的情況下敲除目標基因[2]。該方法利用兩個編碼 Cas9 和 gRNA 的 pX330 質粒、兩個80堿基單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）和一個鈍端來刪除目標大片段基因組區域[2]。
Aimsmass 提供以下 CRISPR-Cas9 基因敲除服務：
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查看高通量 CRISPR-Cas9 基因敲除是大規模發現和驗證基因功能的有力方法。以下是優化高通量 CRISPR-Cas9 基因敲除的一些方法和指南:
CRISPR-Cas9 組件可以通過基于 DNA 的傳遞系統導入培養細胞，例如轉染編碼核靶向 Cas9 和 sgRNA 的質粒，或用病毒顆粒轉導。
現有的指南和工具可用于優化 CRISPR/Cas9 基因組靶向效率和特異性，這將對基因組編輯實驗的結果產生重大影響。
高通量 CRISPR-Cas9 基因敲除是選擇哺乳動物細胞必需基因的一種很有前途的工具。
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穩定敲除細胞系的產生是一個涉及細胞系中特定基因永久破壞的過程。Aimsmass 可提供敲除細胞系的建立服務，借助高通量我司所采取的高通量敲除手段，快速建立單克隆敲除細胞株。我們采取的是直接將 Cas9 蛋白與所需 gRNA 結合的核糖核蛋白（RNP）復合物導入細胞。RNP 的直接遞送一方面加速了基因編輯動力學，另一方面減輕了由于 Cas9 快速降解而導致的脫靶效應。此外，由于 RNP 方法的無 DNA 性質，避免了潛在的轉基因插入。
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使用 CRISPR 技術可以實現穩定的敲低細胞系生成。產生穩定的敲低細胞系的一般步驟：設計 gRNA 構建：使用在線工具（如 CRISPR 設計工具）針對感興趣的基因設計引導 rna(gRNAs)。
轉染：用gRNA和Cas9質粒轉染細胞，采用多種轉染方法，如電穿孔、脂肪轉染或核轉染。
選擇：轉染后，選擇細胞用于選擇標記，如嘌呤霉素或潮霉素。這將選擇已經吸收了質粒的細胞。
單克隆生成：利用有限稀釋或流式細胞術將細胞低密度平板化生成單克隆。
篩選：使用各種方法篩選所需的敲低克隆，如 qPCR, western blotting 或免疫熒光。
驗證：最后，使用功能分析驗證敲除的細胞，以確認感興趣的基因已被敲除。
Aimsmass為 gRNA 的設計、轉染、選擇和篩選提供了多種選擇，能夠及時、高效地生成穩定的細胞系。
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敲除細胞池是用 CRISPR-Cas9 編輯過的異質細胞群，可以作為產生克隆敲除系的一種有吸引力的替代方法。敲除池是通過一次轉染大量細胞而產生的，從而產生具有不同 indel 種群的異質編輯細胞池。單細胞分離可能是一個漫長而無回報的過程，在轉染后使用池可能看起來是獲得結果的快速途徑。敲除細胞池是篩選和初步鑒定編輯細胞的理想選擇[1]。
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